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富血小板血浆在慢性难愈性创面中的研究进展

作者:华北理工大学附属医院  杨彪

  

在过去的几十年里,细胞和分子生物学的发展以及创面愈合和组织再生过程的科学进步,促进了新型多学科领域的研究和发展,如再生医学和组织工程。富血小板血浆(PRP)的出现和应用使再生医学领域发生了革命性的变化,PRP是一种用于刺激和加速组织愈合的新型生物技术,其生物学效应主要归因于其中的血小板分泌体和血浆信号蛋白等成分,PRP可在不同的病理微环境下,通过不同的再生机制,包括止血,炎症,血管生成和细胞外基质的合成等促进创面愈合,缩短创面愈合的时间,此外PRP还能减轻水肿、瘢痕和疼痛,降低感染率,间接地降低截肢率,提高患者的生活质量,减少医疗费用支出。这种方法的多功能性和生物相容性及其简易的制备方案促进了它在许多医学领域的应用,包括骨科、牙周、口腔外科、颌面外科、心脏外科、整形外科、运动医学等学科。本文旨在对PRP在慢性难愈性创面的研究进展做一综述。

 

PRP的特性

 

PRP中血小板的作用 血小板来源于巨核细胞,没有细胞核,包含有3种类型的血小板颗粒:α颗粒、致密体和溶酶体。α颗粒是最大的细胞器,每个血小板大约有50~80个α颗粒,α颗粒直径约200~500nm,包含30多种生物活性蛋白,其中许多在止血和/或组织愈合中起着重要作用。α颗粒存储有黏附蛋白、趋化因子、细胞因子和生长因子等多种生物活性物质。最近的研究表明,促血管生成和抗血管生成因子可能存在于不同的颗粒亚型中,因此可以调节伤口愈合炎症后期相关的血管生成过程。致密颗粒所携带的生物活性因子如三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、血清素、5-羟色胺、多巴胺、组胺、腺苷和钙等用于组织恢复过程。致密体颗粒分泌物缺失将影响机体恢复组织完整性的能力。溶酶体中含有与蛋白质、碳水化合物及脂质降解有关的多种酶类,尽管它们的功能尚未充分探索,但可以肯定的是它们在吞噬和消化胞质成分、受体的分裂、纤溶、细胞外基质成分的降解和重构以及血管系统的调节中发挥着重要作用。

 

血小板活化后,除了发挥止血功能外,在炎症和组织再生中发挥着重要的作用。其通过释放生长因子、细胞因子、趋化因子和细胞外基质调节剂等生物活性物质来介导伤口愈合的每一个阶段。生物活性物质与不同细胞跨膜受体结合后,引发细胞内信号,最终影响核基因的表达,依次为组织愈合奠定了基础。血小板含有纤维连接蛋白、玻连蛋白和层粘连蛋白,血小板因子、5-羟色胺、基质金属蛋白酶及其组织抑制剂的共同作用诱导了细胞外基质的生成和重塑;除了基质合成作用外,血小板可诱导间充质干细胞向组织特异性细胞类型的增殖和分化。

 

血小板也是一种多功能的宿主防御细胞,表达多种蛋白和受体,包括Fc、补体和Nf-MLF受体,以及抗菌肽,有助于协调对细菌的免疫防御,血小板与微生物直接相互作用,有助于清除血液中的病原体。除了免疫调节作用外,血小板也直接影响宿主防御效应细胞的作用。血小板作为止血免疫防御系统的重要组成部分,在不同的感染中发挥着不同的作用。血小板被激活后可以吸收中性粒细胞,清除革兰氏阴性细菌(即它们是调制器),也可通过扩大炎性细胞的数量帮助转移革兰氏阳性菌(即它们是转运体)。最近的研究表明,血小板可以将促炎性巨噬细胞重新极化成修复型,血小板与巨噬细胞在炎症或组织修复损伤过程中的这种联系的发现,可能有助于治疗慢性炎症相关疾病的治疗策略进一步开发。

 

PRP中白细胞及其他抗菌活性物质 白细胞在伤口愈合过程中起着关键作用。第一个迁移到伤口部位的白细胞是中性粒细胞。它们的主要作用是吞噬碎片、微生物和坏死组织,以清洁伤口和防止感染,激活后的中性粒细胞可产生一系列炎性介质,引起炎症级联反应。单核细胞是在伤口部位招募的第二种白细胞,它们成熟为巨噬细胞,并成为主要的细胞类型。巨噬细胞吞噬死亡的中性粒细胞,进一步清除组织碎片。巨噬细胞的其他关键作用包括释放生长因子和细胞因子、并招募其他细胞类型和刺激血管生成。除了生长因子,白细胞可表达多种蛋白酶,如丝氨酸和金属蛋白酶,它们在伤口愈合中起关键作用。因此白细胞在PRP中的存在可能促进修复过程。

 

PRP的抗菌机制尚未完全确定,目前已明确血小板具有宿主防御效应细胞的结构和功能,激活后的血小板颗粒可释放多种生物活性物质,包括趋化因子、协同刺激分子和抗菌肽等参与炎症反应。活化的血小板可与白细胞结合,刺激白细胞功能。血小板还可以合成蛋白质,包括促炎性细胞因子促炎性细胞因子1。Yeaman等从凝血酶诱导血小板的释放物中提取并鉴定了抗菌多肽,发现血小板宿主防御机制是通过释放多种血小板杀菌剂蛋白发挥作用。Tang等报道了人类血小板激活后可释放7种抗菌肽:血小板因子4、RANTES、激活肽3、血小板基础蛋白-4、纤维蛋白肽B、纤维蛋白肽A、血小板碱性蛋白。他们在体外测试了这些肽对大肠杆菌、葡萄球菌和金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和新生隐球菌的抗菌活性。发现它们对细菌的抗菌活性比真菌强,而且抗菌活性是剂量依赖性,并且酸性的pH值可以增强血小板抗菌肽的直接杀菌能力。有学者研究了PRP的体外抗菌活性,发现PRP凝胶抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长,但对肺炎克雷布菌、粪肠球菌或铜绿假单胞菌均无活性。此外,PRP可能诱导铜绿假单胞菌的生长,提示它可能会导致该生物的感染加剧。Cetinkaya等研究自体PRP对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、ESBL阳性肺炎克雷伯菌和碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌的体外抗菌活性进行比较,发现其对三种耐药菌均具有抗菌活性,但对耐万古霉素肠球菌VRE无明显影响。PRP可显著降低炎症反应,并在MRSA 感染的基础上实现伤口愈合。

 

PRP中生长因子的作用 血小板的活化后,α颗粒通过脱粒形式释放生长因子。大约70%的生长因子在10min内被释放,几乎100%的生长因子在1h内被释放。在其约为7d的生命周期中,血小板可继续合成并分泌少量的生长因子。生长因子在创伤愈合和组织再生的复杂过程中起着至关重要的作用。它们是影响其他细胞新陈代谢的信号蛋白,通过与靶细胞细胞膜上的特异性受体结合而起作用,它们为组织愈合奠定了基础。目前已知涉及伤口愈合过程中主要的生长因子包括:它们为组织愈合奠定了基础。目前已知涉及伤口愈合过程中主要的生长因子包括:血小板源生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)-1,IGF-2、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF-β)、角质细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子(HGF),它们在伤口愈合过程中的作用描如下。

 

PDGF是损伤后分泌的第一个生长因子,PDGF有5个亚型(AA、AB、BB、CC、DD),每一种PDGF亚型都被证实在伤口愈合中诱导血管生成和基质合成以及细胞增殖和迁移中发挥重要作用。PDGF刺激许多代谢过程,如PDGF刺激嗜中性粒细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞的有丝分裂和趋化性,促进炎症反应的启动。刺激这些细胞产生蛋白聚糖、透明质酸、纤维连接蛋白;它也促进内皮细胞的增殖和迁移,从而发挥血管生成效果;合成和分泌TGF-β,启动胶原蛋白的合成;激活巨噬细胞产生更多的生长因子,并帮助清除受损组织。PDGF在血管成熟过程中尤为重要,增加血管的结构完整性。在伤口愈合的上皮化阶段,PDGF上调IGF-1和血小板反应蛋白-1的生成。在组织重塑过程中,PDGF通过上调基质金属蛋白酶来帮助破坏旧的胶原蛋白,重塑细胞外基质。

 

VEGF的中心作用是通过调节内皮细胞的增殖和迁移来刺激血管生成,成为启动肉芽组织血管生成过程的主要反应生长因子。VEGF也与FGF协同作用,以刺激血管生成。除了血管生成作用外,VEGF在伤口愈合过程中也起到了淋巴管生成的作用。

 

TGF-β 三种不同的亚型:TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。TGF-β1可作为中性粒细胞、巨噬细胞和成纤维细胞的趋化剂,通过增加与ECM 形成相关的基因的表达,包括纤连蛋白、纤连蛋白受体、胶原蛋白和蛋白酶抑制剂,帮助启动肉芽组织形成,它还参与上调血管生成因子VEGF。TGF-β1的作用与剂量相关,例如:它在低浓度时增强成纤维细胞增殖,但在高浓度时诱导分化。此外,体外研究表明TGF-β1和TGF-β2与瘢痕和纤维化有关,它们促进成纤维细胞分化,细胞外基质沉积,伤口收缩,瘢痕形成,在伤口收缩过程中发挥作用。同时也是金属蛋白酶MMP-1、MMP-3和MMP-9的有效抑制剂。TGF-β3也与血管生成相关。在成纤维细胞生长因子家族(FGF)中,FGF-2、FGF-7和FGF-10被证明是伤口愈合的重要组成部分。FGF对上皮形成、血管生成、肉芽组织形成和组织重塑中有促进作用。FGF是内皮细胞的有丝分裂原,通过内皮细胞的增殖刺激新血管的生长,起到血管生成因子的作用。FGF-2通过刺激毛细血管内皮细胞的浸润和增殖,增加肉芽组织中的血管生成 参与启动肉芽组织形成,从而缩短愈合时间,增加伤口强度,其可调控多种细胞外基质成分的合成和沉积。FGF-7和FGF-10通过刺激角质形成细胞的增殖和迁移在再上皮化中起着重要的作用。此外,FGF-7有助于VEGF的上调,它还刺激内皮细胞产生尿激酶型纤溶酶原激活剂,在血管形成后期起重要作用。

 

EGF影响组织修复中的两个关键作用:细胞增殖和细胞凋亡。通过刺激成纤维细胞、角质形成细胞、血管内皮、平滑肌细胞和上皮细胞来增加伤口愈合。EGF加速了再上皮化,可通过增加创面中成纤维细胞的数量增加伤口的抗拉强度。在慢性创伤的临床试验中,局部EGF治疗增加了上皮化和缩短愈合时间。

KGF诱导角质形成细胞的增殖和迁移,主要在愈合重构阶段发挥作用。重组人KGF-2用于治疗静脉溃疡显示了它们可增强上皮细胞的增殖。IGF主要参与炎症和增殖阶段。IGF-1已经被证明可以增加角质细胞的活力,保护PDGF蛋白以避免降解,并以剂量依赖性的方式促进纤维细胞的生长。HGF这种生长因子由间充质细胞分泌,在上皮细胞和内皮细胞等细胞中起调节细胞生长、运动和形态变化等作用。因此,它直接与上皮修复、肉芽组织形成和血管生成有关,并且与VEGF有协同作用。

 

PRP的制备及激活

 

Ehrenfest等人针对PRP产品的主要细胞和分子成分,提出根据白细胞和纤维蛋白含量将PRP产品分为四大类:富白细胞-血小板血浆(L-PRP)、纯富血小板血浆(P-PRP)、富白细胞-血小板的纤维蛋白(L-PRF)和纯富血小板纤维蛋白(P-PRF)。最近,有学者根据白细胞的存在与否(L或P),纤维蛋白含量(高:PRF;低:PRP),激活或不激活(I或II),血小板浓度(A:900×103/μL;B:900×103/μL~1 700×103/μL;C:>1 700×103/μL),以及制备类别(重力血小板封存技术;标准细胞分离器;自体选择性过滤),用数字和字母字符的组合,提出了更详细的分类系统来区分PRP的类别,例如:L-PRPIB1。这种简单、准确、实用的分类系统有助于去区别文献中对PRP产品的混淆。

 

目前尚无统一的制备标准,主要有血浆分离置换法和密度梯度离心法,其原理是根据全血中各种成分的沉降系数不同,通过不同的离心方法提取PRP,其影响因素包括不同的离心力、离心时间、离心次数、激活剂等。制备方法的不同,产品质量和最终的临床疗效也不同。目前多采用二次密度梯度离心法,第一次离心分离红细胞,第二次离心分离贫血小板血浆(PPP)和富血小板血浆(PRP)。PRP制备完成后,其在抗凝状态下稳定保存8h或更长时间。

 

血小板激活是研究PRP产品的一个重要标准。近年来,人们提出了不同的激活方案,如:牛凝血酶/凝血活酶、凝血酶受体激动剂肽、ITA 胶凝剂、巴曲酶、CaCl2、抗坏血酸等。最常见的激活方法是添加钙/凝血酶混合剂,生成富血小板血浆凝胶。这种激活剂中钙可抵消采血时添加的抗凝血剂,凝血酶除激活血小板外还可以使纤维蛋白原激活为纤维蛋白。PRP无法达到改善组织愈合的一个原因可能是凝血酶浓度较低或只添加凝血酶或CaCl2,因为这些激活方法不会导致血小板生长因子的完全激活和释放。然而,不同来源和方法获得的凝血酶会干扰PRP的治疗效果。牛凝血酶可能出现出血、血栓形成、免疫反应等不良反应。为避免这些不良并发症,自体凝血酶应被优先使用。自体凝血酶可从血清样本中获得,也可通过T-PRP获得。有研究比较了自体凝血酶获取的方法,发现自体血清制备凝血酶有制备更容易、速度更快,避免使用部分PRP等优势。不同激活剂对PRP的性状、生物活性物质的产生及疗效影响不同。

 

有研究比较了葡萄糖酸钙和凝血酶激活PRP后,凝胶形成、生长因子含量及微囊泡浓度变化,得出结论:葡萄糖酸钙缓慢激活PRP,形成的PRP凝胶回缩缓慢,并且释放高含量的bFGF和高浓度的微囊泡,宜于修复关节腔及窦道性创面;凝血酶快速激活PRP,形成的PRP凝胶回缩较快,释放高含量的PDGF-BB和一定浓度的微囊泡,宜于修复急性创伤。血小板计数与生长因子浓度之间的确切关系尚不清楚。有作者认为随着血小板数量的增加,生长因子的浓度也随之增加。一些研究表明,血小板计数与PRP激活后释放的生长因子的类型和数量有关,例如,Sundman等人研究发现血小板计数与TGF-1之间存在正相关关系。也有作者认为,血小板浓度与生长因子浓度成正相关的假设是错误的。

 

目前在PRP中加入白细胞仍存在分歧。虽然有大量的文献详细描述了血小板的伤口愈合和抗菌性能,但在PRP制剂中包含白细胞的问题多年来一直被忽视。尽管白细胞在组织修复和宿主防御中所起的作用得到了广泛的认可,但PRP中所包含的白细胞的潜在作用尚未得到充分的探索。一些作者认为,加入白细胞有助于提高纤维蛋白支架的稳定性,同时增加抗菌潜力。但是也有研究表明,额外的白细胞并不能显著改善PRP的抗菌性能,另外,由于白细胞可分泌金属蛋白酶,以及白细胞中含有的促炎蛋白酶和酸性水解酶,额外的白细胞可能会增加该部位的炎症反应。

 

PRP在慢性难愈性创面中的应用

 

目前对于慢性难愈性创面的具体定义尚未达成共识,国际创伤愈合学会定义慢性难愈性创面为:无法通过正常、有序、及时的修复过程而造成;或者是经过修复而没有恢复解剖和功能上完整状态的伤口。有学者认为,经过30d的标准治疗后,没有完全愈合的创面是慢性难愈性的;有学者则认为如果在6周内没有达到完全愈合,或者没有观察到对治疗有积极反应,那么创面可被定义为慢性难愈性;也有学者认为在3个月内不愈合的创面为慢性难愈性创面。正常的伤口愈合是一种动态协调的组织修复过程,包括凝血、炎症、基质合成、血管生成、纤维增生、上皮化、伤口收缩和重塑。涉及多种细胞类型、生长因子、细胞因子和趋化因子的相互作用,分为四个阶段:止血、炎症、组织形成和组织重塑。然而,由于不同的病因,如慢性静脉疾病、外周动脉疾病、神经病变、动脉高压、物理创伤、血液病、皮肤感染、炎性疾病、肿瘤、营养和医源性改变等,正常的愈合过程被中断,导致慢性炎症阶段的持续阻滞,就会出现慢性难愈性创面。表现为持续高水平的基质金属蛋白酶和促炎细胞因子和持续低水平的金属蛋白酶组织抑制剂和生长因子。低氧和重复的感染促进了过量的蛋白水解酶和随之而来的生长因子和纤维蛋白的缺失,阻滞了伤口的愈合。PRP介导病变治愈的关键作用机制就是调节持续的炎症阶段。在炎性病变背景下,PRP通过分泌生长因子、细胞因子、趋化因子等炎性介质以及趋化因子受体的表达发挥作用。为了消除炎症,富集的活化血小板表现出良好的促炎因子和抗炎因子的平衡能力。PRP能够调节损伤部位的主要炎症细胞(如中性粒细胞和巨噬细胞)的分泌和招募,可以重新启动愈合过程,将伤口从炎症循环转移到愈合的增殖阶段。许多研究表明PRP是促进慢性难愈性创面愈合安全有效的方法。在对慢性难愈性伤口研究的meta分析中,Carter等证实PRP治疗可以积极影响创伤愈合和相关因素,如慢性皮肤创伤的疼痛和感染等因素

 

Ahmed等把56名慢性糖尿病足溃疡患者,随机分成两组,实验组使用PRP治疗,对照组使用抗菌药膏敷料治疗,每周应用2次,结果表明PRP组创面愈合率达86%,对照组为68%,并且与对照组对比创面感染率明显降低。Babaei等观察了150例糖尿病足溃疡患者,皮下注射自体PRP及PRP凝胶局部应用4周后,所有患者的伤口面积均减小,并最终痊愈,经过8个月的随访无一例复发。Afradi等使用PRP治疗100例地中海贫血患者腿部溃疡,治疗4周后溃疡面积开始缩小。面积为2.0~3.125px2 的创面,12.5周后完全闭合;面积为3.5~4.125px2 的创面,13.2周后完全闭合,4.5~6.02 的创面,14周后完全愈合。随访8个月无一例溃疡复发。Suthar等对符合纳入标准的24例不同病因的慢性难愈性创面患者局部使用PRP,包括10例静脉溃疡,9例糖尿病溃疡,3例动脉溃疡和2例压疮。患者创面平均持续时间为16周,在使用PRP 4周后发现创面肉芽组织生长,面积减小,平均愈合时间为(8.2±1.9)周,证实了自体PRP治疗慢性非愈合溃疡的安全性和有效性。Prabhu等[对104例不同原因引起的慢性难愈性溃疡患者进行每周两次同源PRP治疗,溃疡的平均面积为5.75px2。结果85例(81.73%)痊愈,13例(12.5%)进行二次植皮手术愈合。

 

PRP除了作为一种治疗创面的单一疗法外,在与其他疗法(如NPWT、脂肪源性干细胞ASCs)联合使用也表现出显著疗效。Raposio等在一项为期18个月的随机对照试验中,对照组24例患者31个创面,实验组16例患者21个创面,实验组患者在对照组治疗基础条件上联合使用了PRP+ASCs,结果表明联合使用PRP+ASCs后创面愈合速度明显增加,并且无不良并发症发生。有研究联合使用PRP和封闭负压引流技术对44例老年骨外露创面患者治疗,结果表明联合使用组术后7、14d创面肉芽组织覆盖率显著高于单纯应用VSD组,并且创面愈合时间、术后14dVAS疼痛评分及6个月瘢痕评分也低于VSD组。也有研究比较了PRP联合VSD与单纯VSD治疗46例糖尿病足溃疡的疗效。PRP+VSD组先行VSD治疗,然后使用自体PRP外敷创面,后再行VSD治疗;VSD组患者的创面持续行VSD治疗。结果表明治疗2个周期后PRP+VSD组创面愈合率为95.65%,明显高于VSD组47.83%,两组的治疗有效率分别为100.00%、86.96%,并且联合组创面愈合时间明显短于对照组。

 

小结

 

富血小板血浆具有刺激和加速组织愈合的潜力,其疗效在体外和体内都得到了证实,由于PRP是一种自体生物材料,它消除了免疫反应和疾病传播的风险,可望成为治疗慢性难愈性创面的一种高效的替代疗法。然而,关于PRP的生物学机制仍有待进一步突破,需要进行大量的基础科学研究和临床试验研究,进一步明确PRP应用的最佳浓度、最佳时机和最佳的生理环境,制定出PRP制备及应用的统一标准,以便更好地在临床上推广应用。

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